近日，EON体育4平台徐彥輝研究團隊再次在基因轉錄領域取得重要突破，繼2023年底系統描繪了RNA聚合酶Ⅱ轉錄起始連續動態全過程後，再次揭示了RNA 聚合酶轉錄起始動態過程。這一最新研究也為我們逐步打開基因轉錄過程的“黑匣子”，理解生命科學的復雜與精妙提供了新的視角。
RNA聚合酶（RNAPs）是轉錄的核心酶，負責將DNA上的遺傳信息轉錄為RNA。在哺乳動物中，RNA聚合酶進化出三種功能分化的形式：Pol I、Pol II 和 Pol III。其中，Pol II負責轉錄編碼蛋白質的mRNA，由於其與基因表達調控密切相關，長期以來一直是轉錄研究的重點對象。相比之下，Pol III主要轉錄多種短鏈非編碼RNA（如5S rRNA、tRNA和U6 snRNA等），在蛋白質合成、RNA剪接以及細胞周期調控中發揮關鍵作用。
北京時間2025年6月4日晚間，EON体育4平台徐彥輝研究團隊在《自然》（Nature）雜誌在線發表題為“Structural insights into human Pol III transcription initiation in action”的研究論文。該研究重建了人源Pol III轉錄起始的完整動態過程，揭示了轉錄因子與聚合酶催化活性協同驅動Pol III由轉錄起始向延伸過渡的分子機製，為理解真核短鏈非編碼RNA合成的調控提供了關鍵結構基礎。
迎難而上，五年7篇頂刊，揭示轉錄起始的動態調控機製
生命的遺傳物質是DNA，DNA可以通過轉錄形成RNA，RNA則通過翻譯的過程合成蛋白質。轉錄是生命科學中心法則的核心，是基本和復雜的細胞內生命活動，是基因表達調控的核心。轉錄的過程不僅對細胞的生長和發育至關重要，在人的發育、疾病發生過程中起到重要作用，也對生物體對外界環境的適應起著決定性作用。
此前，徐彥輝團隊在《科學》（Science）雜誌上連續發表6篇相關研究論文，揭示多個轉錄起始關鍵過程的分子機製，包括人源BAF復合物的染色質重塑機製、轉錄起始復合物識別基因啟動子及其動態裝配機製、中介體促進RNA聚合酶磷酸化和轉錄激活機製、+1核小體調控轉錄起始的分子機製、發現並鑒定新型轉錄調控復合物INTAC，以及首次用結構重現出了轉錄從頭起始的16個連續動態全過程，揭示了通用轉錄因子（GTFs）和轉錄泡協同RNA聚合酶Pol II調控轉錄起始向轉錄延伸轉變的分子機製。
近年來，徐彥輝研究團隊在Pol III轉錄機製研究方面也持續取得突破，先後解析了人源Pol III延伸復合物（elongation complex，EC）的結構與調控機製、轉錄終止機製，以及完整起始復合物的組裝方式，為全面理解Pol III的轉錄過程提供了重要線索。但上述工作以及目前幾乎所有圍繞Pol III展開的研究工作，都沒有解析Pol III轉錄起始的動態調控機製。科學家們對Pol III轉錄的理解仍然停留在靜止的階段。
雖然不同類型的RNA聚合酶遵循類似的轉錄起始過程——包括啟動子識別、轉錄起始復合物（pre-initiation complex，PIC）組裝、DNA雙鏈解鏈、轉錄泡形成以及RNA合成與轉錄延伸的轉換等步驟。但不同RNA聚合酶在調控因子依賴性、復合物組裝方式及動態構象變化上存在顯著差異，以適應各自所負責基因類型的轉錄需求。系統解析轉錄起始過程中的動態變化，特別是從轉錄起始向延伸的關鍵轉折機製，是深入理解轉錄調控的核心內容，也是目前最具挑戰性的研究難點之一。
2006年，美國羅格斯大學Richard H. Ebright研究組首次利用單分子方法解析了細菌轉錄起始的動態過程，揭示了細菌RNA聚合酶在轉錄起始向延伸轉變過程中遵循“scrunching”機製，即DNA的壓縮產生應力，促使不穩定的轉錄起始復合物向轉錄延伸復合物轉換，實現啟動子逃逸。2023年底，徐彥輝研究團隊首次以單堿基分辨率動態揭示了哺乳動物Pol II從起始到早期延伸的全過程，指出模板鏈在Pol II核心通道的堆積以及NTP水解提供的驅動力是該階段轉變的關鍵因素。同年，比利時魯汶大學Kalyan Das研究組與美國羅格斯大學Smita S. Patel研究組合作報道酵母線粒體RNA聚合酶（mtRNAP）在轉錄起始階段的動態變化，發現非模板鏈的擴張和模板鏈的堆積會導致轉錄泡崩塌和啟動子逃逸，從而驅動轉錄起始向延伸的轉換。
上述工作揭示了不同物種、不同功能RNA聚合酶轉錄起始向延伸的轉折機製，推動了對轉錄起始調控機製的深入理解。然而，目前對Pol III的起始調控機製了解仍較為有限，研究進展相對滯後。對於Pol III的轉錄起始到延伸階段的動態轉換機製，尤其是是否存在與Pol II類似的構象變化，仍知之甚少。回答這些關鍵問題不僅將系統補全真核轉錄調控網絡的理解，還將為RNA聚合酶的功能差異和進化研究提供新的視角。
重建人源Pol III轉錄起始完整動態過程，創新開發活性檢測方法
圖1：Pol III起始復合物組裝與體外轉錄測試
研究團隊參考前期Pol II研究的方法並進行了優化，基於天然U6-1啟動子序列構建了多個包含A-less cassette的啟動子DNA模板。該策略在缺乏ATP的體外轉錄反應體系中，可將轉錄過程“卡頓”在起始位點下遊特定位點，從而捕捉轉錄起始向延伸轉換過程中的關鍵中間態。隨後，研究人員將這些DNA模板與通用轉錄因子（GTFs），包括TFIIIB復合物、SNAPc復合物，以及Pol III共同組裝，啟動體外轉錄反應，並結合UTP、CTP、GTP和3’-dATP，獲得多個不同階段的轉錄復合物（transcription complex，TC），並進行冷凍電鏡單顆粒分析（圖1）。
轉錄起始到延伸的轉換點：RNA長度達到6個核苷酸
研究發現，分析獲得的七個高分辨率Pol III-TC結構（分別停頓於轉錄起始位點下遊4至13位核苷酸）揭示：TC4和TC5屬於起始狀態（initially transcribing complex，ITC），而從TC6起Pol III進入延伸狀態，說明Pol III由ITC向EC的轉變發生於合成第6個核苷酸時（圖2）。值得註意的是，在TC5結構中觀察到RNA-DNA雜合體呈現“傾斜”配對，這是由於模板鏈DNA處於pre-translocate狀態，而新生RNA處於post-translocate狀態，導致雜合體產生不對稱形變。這一非經典構象由轉錄因子BRF2的finger結構域穩定。隨著NTP持續水解，第6個核苷酸被加入至RNA鏈3’端，推動雜合體前移並驅動BRF2-finger結構域退出活性中心（視頻1）。這一關鍵步驟解除對模板鏈DNA的限製，進而引發轉錄因子與Pol III之間的重構，包括BRF2核心結構域以及與其相互作用的TBP、BDP1和SNAPc的解離，實現Pol III的啟動子逃逸。這一轉換過程也在印跡“footprinting”實驗中得到了驗證。
圖2：Pol III轉錄起始動態過程：七個Pol III-TC結構示意圖
與Pol II和線粒體RNAP相比，Pol III完成轉錄起始向延伸的轉換所需RNA鏈長度更短，僅為6個核苷酸（而mtRNAP為8 nt，Pol II為10 nt）。該差異的生理意義仍需進一步探討，推測可能與Pol III所負責的模板類型及其在高效合成短鏈非編碼RNA中的功能要求密切相關。
起始因子在啟動子的滯留和轉錄再起始
研究團隊取得的另一個重要發現是關於轉錄“再起始”的結構證據。盡管Pol III進入延伸狀態後，與通用轉錄因子的直接相互作用被打破，但這些因子仍穩定結合在啟動子上遊區域（圖3）。長期以來，科學界推測Pol III起始因子在一次轉錄完成後不會立即脫離DNA，而是保留在啟動子附近，便於迅速啟動新一輪轉錄。研究人員首次在結構層面觀察到起始因子的啟動子滯留狀態，支持了轉錄再起始機製的存在（視頻1）。
視頻1：Pol III轉錄起始階段連續構象轉變過程。左：顯示完整轉錄復合物整體構象；中：為更清楚觀察轉錄泡的形成過程和DNA與蛋白質之間的相互作用界面，隱藏了部分遮擋啟動子DNA的蛋白結構；右：啟動子DNA構象。其中模板鏈和非模板鏈分別顯示黃色和藍色，轉錄起始位點顯示紅色。
研究發現，早期完成轉錄延伸轉換和快速再起始機製，可能正是Pol III在執行高頻率轉錄任務中所采用的策略。
圖3：Pol III轉錄起始模式圖
不依賴同位素的測活方法
在傳統的分子生物學研究中，轉錄起始活性的檢測主要依賴於使用同位素標記的核苷酸（如磷-32標記的UTP），這一方法已沿用超過半個世紀。然而，該技術存在諸多限製，包括同位素獲取流程復雜、半衰期短、操作安全要求高等問題，嚴重製約了轉錄起始活性的常規定量分析。
為克服上述瓶頸，研究團隊還創新性地建立了一種全新的、無需同位素的轉錄起始活性檢測方法。該方法通過將熒光標記的小分子（pCp-AF647）高效連接至新生RNA的3’羥基，實現了對轉錄起始反應活性的靈敏檢測。該方法靈敏度高，安全低毒，操作簡便，適用於常規分子生物學實驗室，大幅提升了轉錄研究的效率和可重復性。
EON体育4平台青年研究員王茜敏為該文第一作者，EON体育4平台青年研究員陳曦子和EON体育4平台附屬腫瘤醫院/生物醫學研究院/上海梧桐島生命科學研究院研究員徐彥輝為該文通訊作者。
論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41586-025-09093-w
